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 （一）概述

   吊袋式離心機是借離心力分離液相非均一體系的設備。根據物質的沉降系數、質量、密度等的不同，應用強大的離心力使物質分離、濃縮和提純的方法稱為離心。一般說，離心機轉速在20 000r/min以上的稱為超速離心。離心技術，特別是超速離心技術是分子生物學、生物化學研究和工業生產中不可缺少的手段。

   1924年T.Svedberg和Rinde研制出世界上第一臺渦輪超速離心機以來，發展非常迅速，現在已廣泛地應用到科學研究和生產的各個領域。現在離心機轉頭最高轉速已達100000 r/min，最大離心力達700 000 g。

   離心機作為一種手段，具有許多優點。例如，超速離心可在低溫下操作，保護了生物大分子的活性。制備型的離心機負載量大，一次可分離提純幾克樣品，比層析、電泳上的樣品量大得多。分析離心機不僅可測物質的分子量，還可檢驗物質的純度、構象、沉降系數等。因此離心技術在生物學研究中占有重要的地位，是分離、純化細胞、病毒、蛋白、核酸和酶的最方便最有效的工具。

   (二) 離心原理

   當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形態和密度有關，并且又與重力場的強度及液體的粘度有關。象紅血球大小的顆粒，直徑為數微米，就可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。

   此外，物質在介質中沉降時還伴隨有擴散現象。擴散是無條件的絕對的。擴散與物質的質量成反比，顆粒越小擴散越嚴重。而沉降是相對的，有條件的，要受到外力才能運動。沉降與物體重量成正比，顆粒越大沉降越快。對小于幾微米的微粒如病毒或蛋白質等，它們在溶液中成膠體或半膠體狀態，僅僅利用重力是不可能觀察到沉降過程的。因為顆粒越小沉降越慢，而擴散現象則越嚴重。所以需要利用離心機產生強大的離心力，才能迫使這些微粒克服擴散產生沉降運動。  

   離心就是利用離心機轉子高速旋轉產生的強大的離心力，加快液體中顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數和浮力密度的物質分離開。離心力(F)的大小取決于離心轉頭的角速度(ω，r/min)和物質顆粒距離心軸的距離(r，cm)。它們的關系是：F＝ω2R

   為方便起見，F常用相對離心力也就是地心引力的倍數表示。即把F值除以重力加速度g (約等于9.8m/s2.)得到離心力是重力的多少倍，稱作多少個g。例如離心機轉頭平均半徑是6cm，當轉速是60 000r/min時，離心力是240000×g，表示此時作用在被離心物質上的離心力是日常地心引力的24萬倍。

   因此，轉速r/min和離心力g值之間并不是成正比關系，還和半徑有關。同樣的轉速，半徑大一倍，離心力(g值)也大一倍。轉速(r/min)和離心力(g值)之間的關系可用下式換算式中：r為半徑(cm)，g為離心力(g值)

   （三)超速離心機的離心方法

  用離心方法分離生物大分子和亞細胞物質的基本原理是根據它們在液體介質中或者沉降速度不同而形成不同的區帶，或者它們的密度  不同而停留在液體介質中不同的位置而把它們一一分開。前者是沉降速度法，應用該法時液體介質的最大密度要小于樣品中最小顆粒的密度，離心時選用高轉速和短  時間；后者是沉降平衡法，應用該法時液體介質的最大密度要大于樣品中最小顆粒的密度，離心時選用較低轉速和較長時間。

實際操作有幾種形式：

   1.差速離心 這種方法是選擇不同轉速的離心，分別分離各個不同組分。例如先用低速沉降大顆粒和上清液，在高速離心上清沉降中等顆粒，最后超速離心上清沉降小顆粒。采用逐級提高離心力分離上情液的方法，把不同大小的顆粒分開。    這種方法比較簡單，方便。分離的組份沉到管底，因此可以迅速濃縮所要的組份，減少體積。但回收率和純度是有矛盾的，要提高回收率，勢必提高轉速或延長離心時間，這樣大小相近的顆粒也會沉到管底。因此該法多用于粗提純或初步濃縮樣品。

   2.速度區帶(或速度梯度)離心 本法是將樣品放在一個連續的密度梯度液體上，通過離心，大顆粒沉降快，小顆粒沉降慢。經過一段時間，相同的顆粒就在同一深度形成一條帶子，因此把各種組份分開來。它適用于分離密度相同、而大小不同的物質，如不同的蛋白質組份密度都差不多，但分子量不一樣，用本法很容易將其分開。但對密度不同、大小類似的物質則不易分離。  

   蔗糖梯度是一種常用的介質。用不同濃度的蔗糖溶液(5%-60%)配成梯度，用于梯度離心。再分別進行收集處于不同區帶里的各個組份目前，實驗室常用的是電動離心機。電動離心機轉動速度快，要注意安全，特別要防止在離心機運轉期間，因不平衡或試管墊老化，而使離心機邊工作邊移動，一致從實驗臺上掉下來，或因蓋子未蓋，離心管因振動而破裂后，玻璃碎片旋轉飛出，造成事故。因此使用離心機時，必須注意以下操作。

  （1）離心機套管底部要墊棉花或試管墊。

  （2）電動離心機如有噪音或機身振動時，應立即切斷電源，即時排除故障。

  （3）離心管必須對稱放入套管中，防止機身振動，若只有一支樣品管另外一支要用等質量的水代替。

  （4）啟動離心機時，應蓋上離心機頂蓋后，方可慢慢啟動。

  （5）分離結束后，先關閉離心機，在離心機停止轉動后，方可打開離心機蓋，取出樣品，不可用外力強制其停止運動。

  （6）離心時間一般1～2分鐘，在此期間，實驗者不得離開去做別的事。

 一、凝膠電泳實驗注意事項

 1. 瓊脂糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。

 2. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應及時倒入板中，避免倒入前凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡，以免影響電泳結果。

 3. 電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強度和pH，應常更新電泳緩沖液。

 4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5μg的DNA量，加樣量的多少依據加樣孔的大小及DNA中片段的數量和大小而定。當加樣孔大時，樣品上樣量應相應加大，否則會造成條帶淺甚至辯認不清；反之則應適當減少加樣量，但是上樣量過多會造成加樣孔超載，從而導致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現象更明顯。

 5. DNA樣品中鹽濃度會影響DNA的遷移率，平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段的DNA電泳應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。